Убить рак: иридий, человеческий сывороточный альбумин и немного синего света
Одним из самых известных супергероев Marvel всегда считался и будет считаться Логан, он же Росомаха. А какая особенность его тела приходит на ум первой, помимо конечно регенерации со скоростью Флеша? Одним словом — адамантий. Этот редкий металл обладает уникальными свойствами, уничтожить его практически невозможно, а переработка занимает уйму сил. У этого выдуманного вещества имеется несколько эквивалентов в нашей с вами реальности, которые также обладают весьма специфическими свойствами. Среди них особое внимание ученых заслужил иридий. Этот металл вряд ли может сделать из простого человека супер-героя, но вот раковые клетки уничтожать он умеет (Дэдпул бы не отказался от такого). Как ученые пришли к такому выводу, насколько эффективен иридий в борьбе с раком и каково его будущее в онкологии? Нырнем в доклад исследовательской группы за ответами. Поехали.
М Металловедение
Иридий (Ir) это чрезвычайно твердый переходной металл из платиновой группы. Как и вымышленный адамантий, иридий очень стойко переносит коррозию даже при температуре в 2000 °C. Еще одно сходство этих двух металлов в их внеземном происхождении. Точнее сказать, иридия на нашей планете очень мало, посему в большой концентрации он встречается в местах падения метеоритов.
В рассматриваемом нами исследовании ученые создали малеимид-функционализированный октаэдрический органо-иридиевый (III) комплекс Ir1 (1а) в совокупности с ЧСА. Данный комплекс (Ir1-ЧСА) оказался значительно эффективнее в увеличении фосфоресценции в сравнении с «чистым» Ir1, то есть без ЧСА.
В темноте Ir1-ЧСА по большей степени не токсичен для обычных клеток, но проявляет сильную фото-цитотоксичность по отношению к раковым клеткам и их сфероидам (клеточным образованиям).
Синтезированный Ir1 проявлял стабильность в течение 12 часов в темноте и спустя 1 час облучения синим светом. При этом необходимо было проверить углерод-углеродную связь (С=С). Для этого была проведена реакция комплекса Ir1 и цистеина (Cys) в молярном соотношении Cys: Ir1 — 2:1 в [D6]DMSO/D2O при температуре 298 K в течение 30 минут. В результате протонного магнитного резонанса ученые выяснили пиковый показатель виниловых протонов малеимидных групп на отметке в 6.62 ppm (миллионная доля). При добавлении цистеина пики исчезли, но потом вновь возникли уже в диапазоне 2.9…3.9 ppm. Ученые связывают это с конъюгацией цистеина.
Далее ученые проверили способен ли свободный тиол Cys34 из ЧСА вступать в реакцию с С=С. Для этого 30 μM (микромолль) Ir1 инкубировали с ЧСА (0-120 μM) в течение 1 часа. Далее полученные продукты реакций были разделены с помощью обращённо-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ).
При достижении ЧСА в 120 μM пик Ir1 исчезал полностью (соотношение ЧСА: Ir1 = 4:1). Таким образом содержание тиола (SH) составило 0.27±0.1 моль SH на 1 моль ЧСА (1с). Следовательно, концентрация свободных SH-групп из 120 μM ЧСА составляет 32.4±1.2 μM. При таком показателе возникает реакция с 30 μM Ir1, приводя к возникновению аддукта (прямого соединения молекул) Ir1 и ЧСА в соотношении 1:1.
Чистый Ir1 не демонстрировал сильного излучения в водном растворе, в отличие от комплекса Ir1-ЧСА (1d). Чем выше была концентрация ЧСА, тем сильнее становилась фосфоресценция самого Ir1 (1е).
Дабы удалить группы свободных тиолов из ЧСА в раствор было добавлено 100 μM цистина на сутки при температуре 277 K. Полученный продукт соединили с Ir1 на 30 минут. Наблюдения показали значительное снижение фосфоресценции. В случае конъюгата ЧСА-Cys34 и Ir1 (2а) ситуация была противоположной, а это говорит о том, что именно свободный тиол Cys34 является связующим звеном (правильнее говоря, доменом связывания) для Ir1.
Теперь необходимо было более подробно изучить ЧСА, разобрав его на составляющие. Человеческий сывороточный альбумин имеет одну цепь из 585 аминокислотных остатков, среди которых ученым нужно было найти именно те, что усиливают люминесценцию Ir1. Для этого был проведен люминесцентный анализ взаимодействия Ir1 с различными аминокислотами (2b и 2с). И как мы можем видеть на графике 2b, лидером среди аминокислот с колоссальным отрывом стал гистидин (His), усиливающий люминесценцию Ir1 в 37 раз.
Немного разобравшись в том, что и как работает внутри составных компонентов комплекса Ir1-ЧСА, ученые перешли к практическому применению, то есть к опытам.
Сначала 0.4 миллимоль Ir1 разбавили в 20 мл MeOH:H2O, добавили 0.4 миллимоль HSA и перемешивали в течение 1 часа. Далее с помощью конфокальной микроскопии было исследовано распространение Ir1-ЧСА в живых клетках рака легких (A549).
Уже спустя 30 минут Ir1-ЧСА по большей степени концентрировался в цитоплазме раковых клеток. На 60-120 минуте от начала инкубации, комплекс проникал в ядра клеток рака.
Однако стоит отметить, что не весь комплекс проникал в ядра раковых клеток, а только Ir1. Проверка иммунофлуоресцентным методом показала, что ЧСА просто отсутствует в ядрах клеток, попавших под воздействие Ir1
Но ЧСА не исчезает бесследно, он просто остается в цитоплазме и в мембране ядра клетки рака. Получается, что ЧСА полностью выполняет свою функцию: он доставил Ir до ядра клетки, а сам остался снаружи.
Ученые также проверили квантовый выход (утрировано, силу) и время жизни фосфоресценции Ir1 (самого по себе) и комплекса Ir1-ЧСА.
Квантовый выход Ir1 был очень мал (всего лишь 0.001), а время жизни при температуре 298 K составило 182.7 наносекунд (5а). А вот у Ir1-ЧСА квантовый выход был уже 0.036, а время жизни — 871.8 нс. Такая продолжительность фосфоресценции отлично способствует генерации синглетного кислорода (1 O2).
Спектроскопия электронного парамагнитного резонанса с использованием 2,2,6,6-тетраметилпиперидина в качестве спиновой ловушки помогла обнаружить генерацию 1O2 в чистом Ir1 и в комплексе Ir1-ЧСА при иррадиации в 465 нм в течение 20 минут (5b). Как и ожидалось, квантовый выход 1O2 у Ir1-ЧСА был значительно выше (0.83), чем у Ir1 (0.06).
Также необходимо было проверить степень воздействия Ir1-ЧСА и Ir1 на раковые клетки и на здоровые. В качестве раковых клеток выступило три варианта: рак легких A549, гепатома Hep-G2 и устойчивый к цисплатину рак легких A549R. В качестве здоровых клеток использовались MRC-5 (легкие) и LO2 (печень). Эксперимент проводился в двух вариациях освещения: полная темнота на протяжении всего опыта и синий свет.
Клетки инкубировали Ir1 или Ir1-ЧСА в течение 2 часов, промывали с помощью пербората натрия и облучались синим светом в течение 20 минут либо оставляли в темноте (второй вариант опыта). После этого клетки восстанавливались в течение 46 часов.
Воздействие Ir1 на клетки A549 и в темноте (89.6 μM), и при освещении (53.3 μM) практически отсутствовало.
А вот Ir1-ЧСА показал совсем иные результаты. В темноте испытуемый комплекс никак не влиял на раковые клетки, но при освещении степень его цитотоксичности значительно возросла. Подобные результаты, как мы с вами видим из таблицы выше, Ir1 и Ir1-ЧСА показали и по отношению к другим раковым клеткам. При этом здоровые клетки и в темноте, и при освещении не были затронуты Ir1 и Ir1-ЧСА.
Напоследок ученые провели анализ активных форм кислорода (АФК) внутри клеток после светового облучения. В темноте, как и ожидалось, никаких АФК обнаружено не было. А вот в клетках, которые подвергались световому облучению после применения Ir1-ЧСА, АФК были обнаружены (5с).
Для более детального ознакомления с исследованием настоятельно рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.
Э Эпилог
Данным исследованием ученые не пытались изобрести велосипед в виде применения редких металлов в фотодинамической терапии, ибо это уже было сделано ранее с осмием и палладием. Однако никто еще не пробовал использовать иридий, что исследователи и решили исправить. Их труд не оказался бесполезен, так как иридий показал отличные результаты в борьбе с раковыми клетками разных типов, при этом не затрагивая здоровые.
Онкологические заболевания — одни из самых распространенных, каждый год забирающих миллионы жизней. Изобретение новых методов борьбы с этим недугом и совершенствование имеющихся должно и будет продолжаться. Конечно, нам пока еще далеко до тотальной победы над раком, но ученые по всему миру продолжают свою борьбу в лабораториях, как и миллионы больных в палатах.
Не стоит также забывать и факторах, которые приводят к возникновению онкологических заболеваний. Часть из них (экология, вредные привычки и т.д.) человеку вполне по силам ликвидировать.
Источник: https://habr.com/ru/company/ua-hosting/blog/439308/
